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《中国生物制品规程》附录 WHO推荐的白喉类毒素效价测定方法·

可选用以下两种方法之一种进行。

(一)Vero细胞测定抗体法

1 免疫与采血

用生理盐水将吸附白喉类毒素标准品和待检样品以2倍稀释法稀释成3~5个适当稀释度,每一稀释度样品免疫体重10~14g小白鼠8只,皮下注射0.5ml,免疫5周后,每个小白鼠采血,分离血清,56℃30分钟灭活,放-20℃保存。

2 毒素试验量测定

Vero细胞测定白喉抗体试验时毒素试验量采用Lcd/10000。

在96孔培养板中用RPMI1640(或199)培养液将毒素做2倍系列稀释,每孔50μl,然后向各孔中加入50μl标准白喉抗毒素(0.0001IU),用胶带密封,在室温放置1小时后,加入50μlVero细胞悬液(见3项)密封,放37℃CO2孵箱培养6~7天后,观察结果,使细胞死亡的最大毒素稀释度孔(红色)就是Lcd/10000。

Lcd/10000的毒素量约相当于1×10-4Lf的毒素适用于本试验。

3 Vero细胞

RPMI1640(或199)培养液(加青霉素100IU/ml,链霉素100μg/ml,胎牛血清10%)。Vero细胞培养于150cm2培养瓶中,待细胞长成占瓶底80%~100%单层时,弃去上层培养液,加10ml0.25%胰酶,放37℃数分钟,弃去胰酶,加入10ml培养液,打匀细胞进行计数(1瓶150cm2培养瓶大约可得10~40×106细胞)。用培养液调整细胞浓度至2.5×105细胞/ml。

4 阳性对照小白鼠血清

用吸附白喉类毒素免疫1批小白鼠,免疫5周后采血,分离血清,分装小管,冷冻干燥,保存于-20℃。

5 抗体滴定

按下图将培养板编号:

A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12

B1

C1

D1

E1

F1

G1

H1

(1)向每孔加入50μl培养液,但A11、A12和H11、H12孔不加,而G11、G12加100μl培养液。

(2)取8份待检血清,分别加入A1至H1孔各50μl,横向进行2倍系列稀释,直至A10和H10孔。

(3)将标准白喉抗毒素稀释至0.008IU/ml,加入A11、A12、B11和B12孔各50μl,从B11和B12孔开始竖向做2倍稀释至D11和D12孔。

(4)H11和H12孔加入阳性小白鼠对照血清50μl。

(5)除G11和G12孔外,向其余各孔中加入毒素(Ldc/10000)50μl,轻轻转动培养板,混匀,在培养板上贴上胶带将板孔封闭,放室温1小时。

(6)收集Vero细胞,进行计数,并稀释成2.5×细胞/ml的Vero细胞悬液。

(7)室温放置1小时之培养板,去胶带,立即加入50μlVero细胞悬液,再用胶带封闭培养板,放37℃CO2孵箱培养6天。在24小时及48小时检查胶带封闭情况,如出现封闭不严应更换。

(8)培养6天后取出培养板,根据培养液颜色变化记录结果,黄色为(+),红色为(-),羲色不明显者则可用显微镜观察,如单层细胞完整无损则为(+),否则记录(-)。最终结果以打分表示,即变成黄色的最高稀释度孔的2的指数,例如:变黄的最后一孔是1/256即28,则结果记为8。

6 试验要求

E11、E12、F11和F12孔代表毒素量和Vero细胞敏感度都出现(-),如果出现(+),则毒素量和细胞敏感度都很低,应重试。

细胞孔G11、G12和阳性对照孔H11、H12必须是(+),如出现(-),应重视。

Lcd/10000毒素量的准确性,根据以上计划下列各孔中所加标准抗毒素为:

孔A11和A120.0004IU

B11和B120.0002IU

C11和C120.0001IU

D11和D120.00005IU

如毒素用量准确(Lcd/10000),则A11、A12和B11、B12孔应为(+),而C11、C12和D11、D12应为(-),否则应重试。

7 结果计算

用平行线分析法进行结果计算

8 结果判定

待检样品的效价每剂量应不少30IU。如95%可信限大于50%~200%,则95%可信限的低限效价应大于30IU/1个人用剂量。

(二)豚鼠毒素攻击法

1 免疫及攻击

用生理盐水将吸附白喉类毒素标准品和待检样品稀释成等比间隔的3~5个稀释度(中间的稀释度必须在攻毒后能保护约半数动物),每一稀释度样品免疫体重250~300g之豚鼠至少10只,另外5只豚鼠不注射作为对照。免疫后4周,每只免疫豚鼠攻击白喉毒素100LD50,皮下注射1.0ml。对照组健康动物注射100倍稀释之上述毒素,每只皮下注射1.0ml。攻击毒素后观察5日,每日记录结果。

2 试验成立应具备的条件

(1)检品的最低稀释度能保护半数以上动物。

(2)检品的最高稀释度保护半数以下动物。

(3)对照组动物应部分死亡而不全部死亡。

(4)检品和标准品的剂量反应曲线在平行性及直线性上没有太大的偏差。

3 结果计算及结果判定

见Vero细胞法7和8项。