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《中国生物制品规程》蛋白质含量测定·

甲、钨酸沉淀法

1 试剂

1.110%钨酸钠溶液

取钨酸钠10g,加蒸馏水使溶解成100ml。

1.2 0.33mol/L硫酸溶液

量取化学纯硫酸1.86ml,缓缓注入适量的蒸馏水中,待冷加水稀释至100ml。

1.30.145mol/L氯化钠溶液

取氯化钠9g,加蒸馏水使溶解成1000ml。

2 操作

2.1 钨酸除蛋白质

精确量取样品2ml加蒸馏水14ml,加10%钨酸钠2ml,0.33mol/L硫酸2ml,摇匀,静置30分钟过滤。

2.2 精确量取样品1ml,用0.145mol/L氯化钠溶液准确稀释至每ml含氮量1mg左右。

2.3 精确量取稀释液1ml及除蛋白质滤液5ml,分别移入凯氏定氮瓶中,用半微量定氮法测定样品的总氮及非蛋白氮含量。

3 计算

样品总氮含量(mg/ml)=(样品滴定数-空白滴定数)×标准盐酸mol/L×14×稀释倍数

样品非蛋白氮含量(mg/ml)=(样品滴定数-空白滴定数)×标准盐酸mol/L×14×12

样品蛋白质含量(g/ml)=(总氮-非蛋白氮)×6.25×1/10

附注

1.样品蛋白质含量如超过10%(g/ml),除蛋白质时应适当加大样品稀释倍数,10%钨酸钠及0.33mol/L硫酸用量相应地按比例增加,使溶液钨酸浓度仍保持1%。

2.总氮与非蛋白氮可用同一空白。

乙、三氯醋酸沉淀法

1 2%三氯醋酸溶液

取三氯醋酸12g,加蒸馏水溶解至100ml。

2 操作

精确量取一定体积的样品(含蛋白质6~12mg左右,于10ml尖底离心管中,加等体积的12%三氯醋酸混匀,放置半小时后3000r/min离心30分钟,倾净上清,沉淀用蒸馏水约3ml(分数次)洗入凯氏烧瓶,按半数量定氮法测定氮含量。

3 计算

(样品滴定数– 空白滴定数)×标准盐酸mol/L×14

样品蛋白质含量(mg/ml)──────────────────────×6.25

样品ml数

丙、微量法(Lowry法)

1.试剂

1.1 4%碳酸钠溶液

取4g碳酸钠,加蒸馏水溶解成100ml。

1.2 0.2mol/L氢氧化钠溶液

取0.8g氢氧化钠加蒸馏水,溶解成100ml。

1.3 0.04mol/L硫酸铜溶液

取1gCuSO4·5H2O加蒸馏水溶解成100ml。

1.42%酒石酸钾(或0.1mol/L酒石酸钠)

取2g酒石酸钾(或酒石酸钠),加蒸馏水溶解成100ml。

1.5 碱性铜液

临用前取试剂1.1和1.2各25ml,试剂1.3和1.3各0.5ml混匀配制而成。

1.6 酚试剂

称取100g钨酸钠(Na2WO4·2H2O),25g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O),置1500ml烧瓶中,加入700ml蒸馏水,50ml 85%磷酸及100ml浓盐酸,上联回流管(使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞)微沸加流10小时,取下回流管,加入150g硫酸锂,50ml蒸馏水,几滴溴液,煮沸约15分钟,驱除过量的溴。冷却,加蒸馏水稀释至1000ml,过滤,为酚试剂贮备液。

酚试剂贮备液经标准氢氧化钠液滴定,测定酸浓度,而后用蒸馏水稀释至相当1mol/L盐酸浓度,即为酚试剂。

1.7 标准蛋白质溶液

牛血清白蛋白标准品(由检定所统一标定发给),准确稀释至1mg/ml(含0.02%NaN3),为标准蛋白质贮备液。精确量取标准蛋白质贮备液2.5ml于25ml容量瓶中,用含0.02%NaN3的蒸馏水稀释至刻度,为标准蛋白质溶液(100μg/ml)。

2 操作

2.1 样品

精确量取一定体积样品(含蛋白质50μg左右)于试管中,加5ml碱性铜液,混匀,于室温放置10分钟,快速加入0.5ml酚试剂,摇匀,于室温放置30分钟,用650nm波长或红色滤光片比色(呈色后,如发现混浊,经3000r/min离心15分钟后再比色)。

2.2 标准曲线

精确量取标准蛋白质溶液(100μg/ml)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml,分别置于试管中,加蒸馏水补至1ml,其余操作同样品,可得一标准曲线。

3 计算

从标准曲线查出样品相当标准蛋白质溶液之ml数A;

A×0.01%

样品蛋白质含量(g/ml)= ────────

样品ml数

附注

检测A群脑膜炎多糖抗原半成品原液可取1ml(含抗原3~10mg)。